狐狸传染性脑炎中和试验监测方法的建立和应用

柴秀丽, 闫喜军!, 姜莉莉, 吴威, 丛丽, 邵西群, 王凤雪中国农业科学院特产研究所, 吉林吉林132109
摘要&本研究建立了狐狸传染性脑炎中和试验方法%采用该方法对疫苗免疫狐狸进行抗体水平动态监测" 结果表明&该方法特异性强%重复性好%适用于狐狸传染性脑炎活疫苗免疫效果评价"
关键词&狐狸传染性脑炎’中和试验
中图分类号&S852.61 文献标识码:A

狐狸传染性脑炎是由犬腺病毒!型引起狐狸的一种急性!接触性传染病"目前该病已广泛流行于世界各养狐国家"我国于1989 年报道[1,2]狐狸传染性脑炎的发生" 聂金珍等用犬肾传代细胞# MDCK$ 培养和驯化犬腺病毒"型毒株[3]%并成功地研制出狐狸传染性脑炎活疫苗" 本研究建立了血清中和试验方法%并用于狐狸传染性脑炎活疫苗免疫抗体监测%现将试验结果报道如下"1.1 材料
1.1.1 参照病毒#型犬腺病毒弱毒株CAV- 2C%由中国农业科学院特产研究所野生动物人兽共患病研究室保存和鉴定"
1.1.2 细胞系犬肾传代细胞# MDCK$ %由中国兽药监察所提供"
1.1.3 免疫用疫苗采用犬腺病毒CAV- 2C 株生产的狐狸传染性脑炎活疫苗% 每毫升病毒含量为105.00TCID50%由中国农业科学院特产研究所生产%批号为20040601!
1.1.4 参照血清犬腺病毒阳性血清" 本研究室制备"中和抗体效价# SN$ 为1!256"犬腺病毒阴性血清" 采自健康北极狐"SN!1"4% 将血清56#灭活30min 备用"用于中和试验血清过滤除菌后使用!1.1.5 待检血清分别采自辽宁& 黑龙江两省养狐场" 共10 份血清"56$灭活30min 后过滤除菌"用于中和试验!
1.1.6 试验动物健康北极狐" 由中国农业科学院特产研究所毛皮动物实验基地提供" 中和抗体效价!1%4!
1.2 方法
1.2.1 狐狸传染性脑炎病毒含量的测定启封冻干病毒" 用细胞生长液对病毒进行10 倍系列稀释成10- 1&10- 2&10- 3 至10- 6" 取10- 3~10- 6 的稀释度进行毒价的测定,每个稀释度接种4 孔"每孔0.2mL’然后于各孔中加入1.8mL MDCK 细胞悬( 2~3&109 个/L 细胞$ "最后一列孔接种细胞生长液"为正常细胞对照% 于5’CO2 培养箱37(培养"逐日观察结果,记录细胞出现CPE 孔" 至接种后第5d" 按Reed -Muench 方法计算每毫升病毒的TCID50%1.2.2 血清中和试验采用固定病毒)稀释血清的
方法" 用细胞维持液将阳性血清进行2 倍系列稀释( 选4 个稀释度$ " 分别加入50 个&100 个&200 个&400 个TCID50 的病毒悬液" 经37*和32+分别感作1 h 后, 加入24 孔板, 每个稀释度加4 孔, 每孔加0.2mL%然后于各孔中加入1.8mL MDCK 细胞悬液"置5% CO2 培养箱内( 37,和32-, 湿度均为60%~80%$ 培养"同时设血清毒性对照&阴性血清对照&病毒对照及正常细胞对照% 观察5d 判定结果"以能保护半数接种细胞不出现细胞病变的血清稀释度作为终点" 按改进的Reed.Muench 法计算血清的50%中和效价%
1.2.3 重复性试验10 份待检血清按照1.2.2 项确立的方法测定中和抗体效价"重复3 次%
1.2.4 特异性试验按照1.2.2 项确立的方法" 用200 个TCID50 的狐狸脑炎病毒量"分别测定狐狸脑炎病毒&狂犬病病毒( RV$ &犬瘟热病毒( CDV$ &犬细小病毒( CPV$ 阳性血清对狐狸脑炎病毒的中和作用,进行特异性检验%
1.2.5 中和试验方法的应用选择健康北极狐15只"接种狐狸传染性脑炎活疫苗"1mL/ 只"分别于接种后7d&14d&21d&30d&60d&120d&180d&240d 采血"分离血清"血清56/灭活30min 后备用% 用建立的中和试验方法监测疫苗免疫后不同时期的狐狸血清中和抗体( SN$ 水平%

2 结果
2.1 中和试验适宜条件的筛选结果根据病毒含量测定结果" 选用不同的病毒含量进行中和试验"检测参考阳性血清的SN 效价"结果见表1%

表1 中和试验适宜条件的筛选结果中和抗体效价( Lg$ 及病变出现时间( d$
50TCID50 100TCID50 200TCID50 400TCID50
2.77 2.56 2.47 2.47
415 325 4 334
2.56 2.47 2.47 2.34
345 355 364 374
测定结果表明" 以50 个和100 个TCID50 病毒含量进行试验细胞病变出现缓慢" 尤其50 个TCID50 试验组SN 结果偏高’ 病毒含量为200 个和400 个TCID50 时"出现细胞病变的结果和时间比较规律"两个温度条件试验结果无明显差异% 因此"选用200 个TCID50 的病毒量"370中和1h 为反应条件%
2.2 重复性试验结果10 份待检血清采用中和试验进行3 次重复性试验"结果无明显差异"说明建立的中和试验方法具有较好的重复性"见表2%中和抗体效价( Lg$ 及病变出现时间( d$
2.3 特异性试验
狐狸脑炎病毒阳性血清可以中和病毒! 不出现细胞病变"细小病毒#犬瘟热病毒和狂犬病毒阳性血清试验组均出现细胞病变, 说明该方法具有较高的特异性$
2.4 中和试验方法对疫苗免疫狐狸中和抗体% SN&
监测结果疫苗免疫狐狸后!第7d 血清中和抗体100%阳转! 免疫14d 中和抗体明显升高!SN 抗体均在1!32 以上!疫苗免疫21~30d 抗体达到高峰!高峰期持续相当长时间!免疫后240d 中和抗体仍在1"32 以上

3 结论与讨论
3.1 血清中和抗体水平的高低反映了机体抗病毒能力! 体现了动物的免疫水平’ 本研究采用200 个TCID50 狐狸脑炎病毒建立了狐狸脑炎中和试验方法!经重复性#特异性试验表明该方法能够准确地反映免疫狐狸的抗体水平’
3.2 血清中和试验应用于狐狸传染性脑炎活疫苗抗体监测!结果表明免疫狐14d 抗体达到1#32 以上!免疫21~30d 时SN 抗体达到高峰! 免疫240d 仍保持较高的抗体水平! 该方法适用于狐狸传染性脑炎活疫苗免疫效果的评价’
参考文献
[1] 张国昌, 徐景清$ 丹麦进口银狐发生脑炎的诊断报告[J]%动物检疫!1989!4(24&
[2] 钟志宏,夏咸柱,赵弈, 等’狐狸脑炎病毒的分离鉴定和流行病学调查[J](兽医大学学报!1990!10(2)(111- 117)
[3] 聂金珍!郑海发!吴威, 等*犬腺病毒+型病毒株的致弱及狐狸脑炎弱毒苗的研究[J],中国农业科学!1992!25% 2&